Lankide:Juneazkarate/Proba orria

Mutagenesi zuzendua, gene baten DNA sekuentzian eta edozein produktu genikotan, nahita mutazio espezifikoak eragiteko erabiltzen den biologia molekularreko metodo bat da. Oligonukleotidoen bidezko mutagenesi zuzendua edota leku batera zuzendutako mutagenesi espezifiko bezala ere ezagutzen da. DNA, RNA eta proteinak bezalako molekulen estruktura eta jarduera biologikoa aztertzeko baliagarria da.

Laborategiko teknika garrantzitsuenetarikoen artean dago DNA sekuentzietan mutazioak sartu eta horrela DNA liburutegiak sortzerako orduan. Mutagenesi zuzendua lortzeko zenbait metodo existitzen diren arren, oligonukleotidoen sintesiaren kostua gutxitzearekin batera gene artifizialen sintesia erabiltzen hasi da mutagenesi zuzenduaren alternatiba gisa. 2013. urtetik aurrera, birusekiko defentsa prokariotoan oinarritzen den CRISPR/Cas9 teknologiaren garapenak genoma editatzea ahalbidetu du eta horrela mutagenesia erraztasun erlatiboarekin garatu daiteke in vivo.

Historia

Erradiazio bidezko edo mutageno kimikoen bidezko mutagenesia burutzeko lehenengo saiakerak ez ziren leku jakin baterako espezifikoak, ondorioz, zorizko mutazioak sortzen zituzten. Beranduago, nukleotidoen analogoak eta beste produktu kimiko batzuk erabiltzen hasi ziren mutazio puntual lokalizatuak sortzeko asmotan. Aipatutako produktu kimiko hauen adibide batzuk ondorengoak izan daitezke: aminopurina, nitrosoguanidina eta bisulfitoa.

Mutagenesi zuzendua 1974. urtean lortu zen Charles Weissmann-en laborategian, N⁴-hidroxizitidina nukleotidoaren analogo bat erabiliz, zeinak GC-tik AT-rako trantsizioa induzitzen duen. Hala ere, mutagenesi metodo hauek sor dezaketen mutazio motaren arabera mugatuta daude eta ez dira beranduago aurkitutako metodoak bezain espezifikoak.

1971an Clyde Hutchison eta Marshall Edgell ikerlariek frogatu zuten,  ϕX174 fagoaren zati txikiak eta errestrikzio nukleasak erabiliz mutanteak ekoiztea posible zela. 1978an  Hutchison eta Michael Smith mutagenesi gidatura gehiago gerturatu ziren, oligonukleotidoak erabilz DNA polimerasaren bidez hasleak luzatzeko metodo batean. Poriektu honetan parte hartzeari esker, 1993. urtean Michael Smith ikerlariak Kimikako Nobel Saria lortu zuen Kary B. Mullis-ekin batera, azken hau polimerasaren kate-erreakzioa asmatu zuena izan zelarik.

Oinarrizko mekanismoa

Oinarrizko prozedura burutzeko, DNA hasle labur bat sintetizatu behar da. Hasle sintetiko horrek intereseko mutazioa izango du eta mutazio gunearen inguruan dagoen DNA moldearen osagarria da, beraz, intereseko genearen DNArekin hibridatu daiteke. Mutazioa nukleotido bakarraren aldaketa bat izan daiteke (mutazio puntual bat), hainbat nukleotidoren aldaketa, delezioa edo insertzioa. Ondoren, DNA katearen sintesia ematen da DNA polimerasa entzima erabiliz harizpi bakarreko hasletik abiatuta. Horretarako, DNA kate moldea oinarritzat hartzen da, sintesian horren osagarriak diren nukleotidoak gehituz. Horrela kopiatutako geneak mutazioa izango du, eta zelula ostalari edo bektore batean sartuz, hau klonatu egiten da. Azkenik, mutanteak DNAren sekuentziazioaren bidez hautatzen dira, intereseko mutazioa dutela egiaztatzeko.

Metodoak

Hasle bakar baten luzapena erabiltzen zuen jatorrizko metodoa ez zen eraginkorra, mutanteen errendimendu baxuaren ondorioz. Nahasketak jatorrizko harizpi ez-mutatua eta mutatua ditu, progenie mutanteen eta ez-mutanteen populazio mistoa sortuz. Gainera, eredutzat erabilitako jatorrizko harizpia metilatuta dago, kate mutantea metilatu gabe dagoen bitartean, eta mutanteak kontra-hautatuak izan daitezke, harizpi metilatuaren DNA foboratzen duen konponketa mekanismo bat dagoelako. Ondorioz, mutante gutxiago izatea eragingo du. Orduz geroztik, mutagenesiaren eraginkortasuna hobetzeko ikuspegi asko garatu dira.

Leku batera zuzendutako mutagenesia burutzeko hainbat metodo dauden arren, gehienak ez dira laborategian erabiltzen. Izan ere, gaur egun dauden teknika berriek modu sinpleago eta errazago batean sortzen dituzte lekuarekiko espezifikoak diren mutazioak geneetan.

Kunkel-en metodoa

1985ean, Thomas Kunkelek teknika berri bat aurkeztu zuen zeinak mutanteak hautatzeko beharra murrizten duen. Mutatu nahi den DNA sekuentzia M13mp18/19 bezalako fasmido (bioteknologian erabiltzen de klonazio bektore bat) batean txertatzen da eta gero dUTPasa (dut) eta urazilo deglukosidasa (udg) entzimarik gabeko  E. coli andui batean transformatzen da. Bi entzima horiek DNA konponketa mekanismoetako bide batean parte hartzen dute, zeinak mutazioen kromosoma bakterioanoak babesten dituen dCTP eta dUTP nukleotidoen desaminazio espontaneoaren bitartez. dUTPasaren urritasunak dUTP-aren deskonposizioa ekiditen du eta horrek zelulan dUTP maila altuetan egotea eragiten du. Urazilo deglukosidasaren urritasunak aldiz, sintetizatu berri den DNA-tik uraziloa ezabatzea ekiditen du. Mutazio bikoitzdun E.coli bakterioak fagoaren DNA erreplikatzen du eta beraz, bere makineria entzimatikoak akats gisa dUTP gehitu dezake dTTP gehitu beharrean, horrek urazilo batzuk (ssUDNA) dituen kate bakarreko DNA sortzea eragingo duelarik. ssUDNA hori medioan askatutako bakteriofagotik isolatu eta gero mutagenesirako eredu bezala erabiltzen da. Haslearen luzapenerako intereseko mutaziodun oligonukleotido bat erabiliko da. Eratzen den DNA heteroduplexaren harizpi bat parentala izango da, mutatu gabea eta dUTP duena, beste harizpia aldiz mutatua izango da eta dTTP edukiko du. Jarraian, DNA dut eta udg geneak dituen E. coli andui basati batean transformatzen da. Kasu honetan, urazilodun DNA harizpi parentala degradatu egiten da eta modu horretan geratzen den DNA gehiena harizpi mutatuak osatzen du.

Cassette bidezko mutagenesia

Beste metodoetan ez bezala, cassete bidezko mutagenesian ez da DNA polimerasaren bidezko haslearen luzapena gertatzen. Metodo honen bidez, DNA zati bat sintetizatzen da, ondoren plasmido batean txertatzen dena. Murrizketa entzima baten bidez, plasmidoaren gune espezifiko batean ebaketa egiten da, ondoren, mutazioa duten eta osagarriak diren oligonukleotidoak plasmido horretara lotzen dira ligazio bidez. Plasmidoa eta oligonukleotidoak mozten dituzten murrizketa entzimak berdinak izan ohi dira, horrela, plasmidoak dituen mutur itsaskorren eta txertatutako oligonukleotidoen arteko lotura ematen da. Metodo honek, %100eko eraginkortasuna duten mutanteak sortzeko aukera ematen du, baina mutatu nahi den eskualdearen inguruko murrizketa guneen erabilgarritasunagatik mugatua dago.

PCR bidez zuzendutako mutagenesia

Mutagenesi bidezko klonazioa egiteko ohiko modua adierazten da, endekatutako oligonukleotidoak erabiliz. Intereseko genearen PCRa burutzen da,eta horretarako alde batetik moldearekiko (urdina) osagarriak diren oligonukleotidoak eta bestetik nukleotido (gorria) bakarra (edo gehiago) desberdina duten oligoukleotidoak erabiltzen dira. Osagarria ez den gunean endekatuta dauden hasleak PCR berberan erabiltzen dira. Hori dela eta, PCRaren hainbat produktu lor daitezke, produktu bakoitzak mutazio mota desberdinak izanik (mutazio bakoitzak irudian kolore bat dauka).

Aurreko teknikan aipatutako mutagesi guneek dituzten mugak gainditzeko, PCR teknika erabilgarria da, oligonukleotidoz osatuta dauden hasleak dituena. Horrela, bi murrizketa lekuak barne hartzen dituen sekuentzia luzeagoa sintetizatuko da. PCRaren bidezko anplifikazio esponentzialaren ondorioz, gure intereseko mutazioa duen zatia lortzen da, gel elektroforesia erabiliz mutatu gabeko jatorrizko plasmidotik banatu ahal izateko kantitate nahikoa izango duena. Banatutako edo isolatutako zati hau biologia molekular birkonbinatuaren teknikak erabiliz jatorrizko gunean txertatzeko aukera dago. Dena den, teknika honen zenbait aldaera desberdin egon daitezke. Alde batetik, PCR sinpleenak mutazio gunea DNA sekuentziaren mutur batean kokatzen du, beraz, zatia lortzeko erabili diren bi oligonukleotidoen artean, bakarrak mutazioa adieraziko du. Hau PCRan pausu bakarra izango da, baina hasle oso luze bat ez erabiltzekotan, oraindik mutazioaren alboko murrizketa gune egoki baten presentzia eskatzen du. Hori dela eta, PCRaren beste aldaerek bi edo hiru oligonukleotido erabiltzen dituzte. Horietariko bi komenigarriak diren murrizketa guneetan dauden oligonukleotido ez mutagenikoak izan daitezke eta digerituta edota plasmido bati lotuta egoten dira. Mutagenikoa den oligonukleotidoa, aldiz, isolatutako DNA sekuentziako edozein gunerekiko osagarria izan daiteke, komenigarria den murrizketa gunetik urrun egon arren. Metodo hauek, hainbat PCR pausu behar dituzte, amaieran lotuko den sekuentziak gure intereseko mutazioarekin izan dezan. Gure intereseko mutazioa duen eta errestrikzio gune egokiak dituen sekuentzia ekoizteko diseinua garatzeko zenbait software erabil daitezke, horien artean, SDM-Assist.

Plasmido osoaren mutagenesia

Plasmidoa manipulatzeko, mutagenesi zuzenduko zenbait teknika sinpleagoak eta eraginkorragoak diren beste teknika batzuengatik ordezkatuak izan dira, azken hauek erabilerrazak eta kit erakoak izaten direlarik. Teknika hauen adibide bat Quikchange metodoa da, bertan osagarriak diren bi hasle mutageniko erabiltzen dira plasmido guztia anplifikatzeko. Anplifikazio hau termoziklazio erreakzio baten bitartez lortzen da, fideltasun altuko DNA polimerasa bat erabiliz, zeinak ez duen harizpia desplazatzen pfu polimerasak egiten duen bezala. Erreakzioak DNA zirukular akastu bat sortzen du. DNA moldea ezabatua izan behar da digestio entzimatikoaren bitartez, DNA metilatuarekiko espezifikoa den Dpnl bezalako errestrikzio entzima bat erabiliz. E. coli bakterioaren andui gehienetatik abiatuz ekoiztutako DNA guztia metilatuta egongo da; E. coli bakterioan biosintetizatzen den plasmido moldea, beraz, digeritua izango da eta plasmido mutatua aldiz, in vitro sortzen dena eta ondorioz metilatuta ez dagoena, digeritu gabe geratuko da. Harizpi bikoitzeko plasmidoen mutagenesi metodo hauetan, termoziklazio erreakzioa erabili daitekeen arren, ez da DNA esponentzialki anplifikatzea behar, PCRan gertatzen den bezala. Bestalde, anplifikazioa lineala da eta ondorioz ez da guztiz zuzena PCR gisa definitzea, ez baitago kate erreakziorik.

Kontuan hartu behar da, pfu polimerasak harizpia despalazatu ahal duela, luzapen tenperatura altuago batean (≥70 °C), eta horrek esperimentuaren porrota ekar dezakela, hori dela eta, luzapen erreakzioa gomendatutako tenperaturan burutu behar da, 68 °C. Aplikazio batzuetan ikusi da, motodo honek hasleen kopia ugariren txertaketa bultzatzen duela. Metodoaren bariazio batek, SPRINP gisa ezagutzen dena, artefaktu hau ekiditen du eta horregatik lekuko mutagenesi zuzendu mota askotan erabili izan da.

Oligozuzendutako helburuen (SMOOT) ekorketa bidezko mutagenesia bezalako beste teknika batzuk, modu semialeatorio batean oligonukleotido mutagenikoak konbinatu ahal dituzte plasmidoen mutagenesian. Teknika honek plasmidoen mutagenesiaren liburutegiak sor ditzake, mutazio bakarretatik gene oso baten kodonen mutagenesira arte doazenak.

Mutagenesi zuzenduaren metodoak in vivo

• Delitto perfetto
• “pop-in-pop-ou” trasplantea
• Geneen ezabapen zuzena eta leku batera zuzendutako mutagenesi espezifikoa PCR eta markatzaile birziklagarri baten bidez
• Geneen ezabapen zuzena eta leku batera zuzendutako mutagenesi espezifikoa PCR eta markatzaile birziklagarri baten bidez, eskualde homologo luzeak erabiliz
• Leku batera zuzendutako mutagenesia in vivo oligonukleotido sintetikoekin

CRISPR

2013. urtetik, CRISPR-Cas9 teknologiaren garapenak genomako mutazioen txertaketa eraginkorra ahalbidetu du organismo mota askotan. Metodo honek ez du transposonen tartekatze gune baten beharrik, ez du markatzeilerik uzten eta bere eraginkortasun zein sinpletasunak genomaren ediziorako metodo erabilienetariko batean bilakatu du.

Aplikazioak

Leku batera zuzendutako mutagenesia, propietateetan hobekuntzak edo berezitasunak dituen arrazionalki diseinatutako proteina bat ekoizteko gai diren mutazioak sortzeko erabiltzen da (proteinen ingeniaritza).

Irudi honek posizio bakarreko asetze mutagenesia erakusten du 10 hondakineko proteina teoriko batean. Proteina basatiaren bertsioa goiko aldean agertzen da, M batekin, lehen aminoazido metionina irudikatuz, eta* itzulpenaren amaiera irudikatuz. Jarraian, isoleuzinaren 19 mutanteak ageri dira, 5. posizioan.

Ikerkuntzako tresnak: DNAko mutazio espezifikoek DNA sekuentzia baten edota proteina baten funtzio eta propietateak ikertzea ahalbidetzen du ikuspegi arrazional batetik. Gainera, mutagenesi zuzenduaren bidez proteinetan emandako aminoazido bakar baten aldaketak itzulpenaren osteko aldaketen garrantzia ulertzen lagundu dezake. Adibidez, proteina substratu batean serina konkretu bat alanina batengatik aldatzeak, fosfato taldearen lotura blokeatzen du, zeinak fosforilazioa ikertzea ahalbidetzen duen. Ikuspegi hau kinasa HIPK2 bidezko CBP proteinaren fosforilazioa aurkitzeko erabili da. Beste ikuspegi global bat, lekuen asetze mutagenesia da, non kodon bakarra edo kodon taldeak ordezka daitezkeen aminoazido aukera posible guztiekin, posizio espezifikoetan.

Aplikazio komertzialak: Proteinak eraldatuak izan daitezke aplikazio espezifiko batera egokituko diren forma mutatuak ekoizteko. Adibidez, detergeneteek subtilisina eduki dezakete, zeinaren forma basatia lejiagatik oxidatua izan daitekeen metionina bat duen, proteinaren aktibitatea prozesuan zehar nabarmenki txikituz. Metionina hau alanina edota beste hondar batzuez ordezkatua izan daiteke, oxidazioarekiko erresistente bilakaraziz eta lejiaren presentzian proteina aktibo mantentzea lortuz.

Genearen sintesia

DNA oligonukleotidoen sintesiaren kostua txikitzen doan heinean, gene baten sintesi artifizial totala bideragarria bilakatzen ari da, geneetara mutazioak sartzeko orduan. Metodo honek, mutagenesi hedagarria ahalbidetzen du leku desberdinetan, genearen kodonen birdiseinua barne hartuz gene hori organismo konkretu batentzat optimizatzeko.

Erreferentziak

1. Hsu PD, Lander ES, Zhang F (June 2014). "Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering". Cell. 157 (6): 1262–78. doi:10.1016/j.cell.2014.05.010. PMC 4343198. PMID 24906146.
2. Kilbey, B. J. (1995). "Charlotte Auerbach (1899-1994)". Genetics. 141 (1): 1–5. doi:10.1093/genetics/141.1.1. PMC 1206709. PMID 8536959.
3. Shortle, D.; Dimaio, D.; Nathans, D. (1981). "Directed Mutagenesis". Annual Review of Genetics. 15: 265–294. doi:10.1146/annurev.ge.15.120181.001405. PMID 6279018.
4. Caras, I. W.; MacInnes, M. A.; Persing, D. H.; Coffino, P.; Martin Jr, D. W. (1982). "Mechanism of 2-aminopurine mutagenesis in mouse T-lymphosarcoma cells". Molecular and Cellular Biology. 2 (9): 1096–1103. doi:10.1128/MCB.2.9.1096. PMC 369902. PMID 6983647.
5. McHugh, G. L.; Miller, C. G. (1974). "Isolation and Characterization of Proline Peptidase Mutants of Salmonella typhimurium". Journal of Bacteriology. 120 (1): 364–371. doi:10.1128/JB.120.1.364-371.1974. PMC 245771. PMID 4607625.
6. D Shortle & D Nathans (1978). "Local mutagenesis: a method for generating viral mutants with base substitutions in preselected regions of the viral genome". Proceedings of the National Academy of Sciences. 75 (5): 2170–2174. Bibcode:1978PNAS...75.2170S. doi:10.1073/pnas.75.5.2170. PMC 392513. PMID 209457.
7. R A Flavell; D L Sabo; E F Bandle & C Weissmann (1975). "Site-directed mutagenesis: effect of an extracistronic mutation on the in vitro propagation of bacteriophage Qbeta RNA". Proc Natl Acad Sci U S A. 72 (1): 367–371. Bibcode:1975PNAS...72..367F. doi:10.1073/pnas.72.1.367. PMC 432306. PMID 47176.
8. Willi Müller; Hans Weber; François Meyer; Charles Weissmann (1978). "Site-directed mutagenesis in DNA: Generation of point mutations in cloned β globin complementary DNA at the positions corresponding to amino acids 121 to 123". Journal of Molecular Biology. 124 (2): 343–358. doi:10.1016/0022-2836(78)90303-0. PMID 712841.
9. Hutchison Ca, 3.; Edgell, M. H. (1971). "Genetic Assay for Small Fragments of Bacteriophage φX174 Deoxyribonucleic Acid". Journal of Virology. 8 (2): 181–189. doi:10.1128/JVI.8.2.181-189.1971. PMC 356229. PMID 4940243.
10. Marshall H. Edgell, Clyde A. Hutchison, III, and Morton Sclair (1972). "Specific Endonuclease R Fragments of Bacteriophage X174 Deoxyribonucleic Acid". Journal of Virology. 9 (4): 574–582. doi:10.1128/JVI.9.4.574-582.1972. PMC 356341. PMID 4553678.
11. Hutchison CA, Phillips S, Edgell MH, Gillam S, Jahnke P, Smith M (September 1978). "Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence" (PDF). J. Biol. Chem. 253 (18): 6551–60. doi:10.1016/S0021-9258(19)46967-6. PMID 681366.
12. Braman, Jeff, ed. (2002). In Vitro Mutagenesis Protocols. Methods in Molecular Biology. Vol. 182 (2nd ed.). Humana Press. ISBN 978-0896039100.
13. Kunkel TA. (1985). "Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection". Proceedings of the National Academy of Sciences. 82 (2): 488–92. Bibcode:1985PNAS...82..488K. doi:10.1073/pnas.82.2.488. PMC 397064. PMID 3881765.
14. Wells, J. A.; Estell, D. A. (1988). "Subtilisin--an enzyme designed to be engineered". Trends in Biochemical Sciences. 13 (8): 291–297. doi:10.1016/0968-0004(88)90121-1. PMID 3154281.
15. Karnik, Abhijit; Karnik, Rucha; Grefen, Christopher (2013). "SDM-Assist software to design site-directed mutagenesis primers introducing "silent" restriction sites". BMC Bioinformatics. 14 (1): 105. doi:10.1186/1471-2105-14-105. ISSN 1471-2105. PMC 3644487. PMID 23522286.
16. Papworth, C., Bauer, J. C., Braman, J. and Wright, D. A. (1996). "Site-directed mutagenesis in one day with >80% efficiency". Strategies. 9 (3): 3–4.
17. a b Edelheit, O; Hanukoglu, A; Hanukoglu, I (2009). "Simple and efficient site-directed mutagenesis using two single-primer reactions in parallel to generate mutants for protein structure-function studies". BMC Biotechnol. 9: 61. doi:10.1186/1472-6750-9-61. PMC 2711942. PMID 19566935.
18. Cerchione, Derek; Loveluck, Katherine; Tillotson, Eric L.; Harbinski, Fred; DaSilva, Jen; Kelley, Chase P.; Keston-Smith, Elise; Fernandez, Cecilia A.; Myer, Vic E.; Jayaram, Hariharan; Steinberg, Barrett E. (16 April 2020). "SMOOT libraries and phage-induced directed evolution of Cas9 to engineer reduced off-target activity". PLOS ONE. 15 (4): e0231716. Bibcode:2020PLoSO..1531716C. doi:10.1371/journal.pone.0231716. ISSN 1932-6203. PMC 7161989. PMID 32298334.
19. Storici F.; Resnick MA. (2006). The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast. Methods in Enzymology. Vol. 409. pp. 329–45. doi:10.1016/S0076-6879(05)09019-1. ISBN 9780121828141. PMID 16793410.
20. Storici F.; Resnick MA (2003). "Delitto perfetto targeted mutagenesis in yeast with oligonucleotides". Genetic Engineering. 25: 189–207. PMID 15260239.
21. Damien Biot-Pelletier and Vincent J. J. Martin (2016). "Seamless site-directed mutagenesis of the Saccharomyces cerevisiae genome using CRISPR-Cas9". Journal of Biological Engineering. 10: 6. doi:10.1186/s13036-016-0028-1. PMC 4850645. PMID 27134651.
22. Xu S (20 August 2015). "The application of CRISPR-Cas9 genome editing in Caenorhabditis elegans". J Genet Genomics. 42 (8): 413–21. doi:10.1016/j.jgg.2015.06.005. PMC 4560834. PMID 26336798.
23. Kovács KA, Steinmann M, Halfon O, Magistretti PJ, Cardinaux JR (November 2015). "Complex regulation of CREB-binding protein by homeodomain-interacting protein kinase 2" (PDF). Cellular Signalling. 27 (11): 2252–60. doi:10.1016/j.cellsig.2015.08.001. PMID 26247811.
24. Reetz, M. T.; Carballeira J. D. (2007). "Iterative saturation mutagenesis (ISM) for rapid directed evolution of functional enzymes". Nature Protocols. 2 (4): 891–903. doi:10.1038/nprot.2007.72. PMID 17446890. S2CID 37361631.
25. Stauffer CE, Etson D (October 10, 1969). "The effect on subtilisin activity of oxidizing a methionine residue". Journal of Biological Chemistry. 244 (19): 5333–8. doi:10.1016/S0021-9258(18)63664-6. PMID 5344139.
26. Estell DA, Graycar TP, Wells JA (10 June 1985). "Engineering an enzyme by site-directed mutagenesis to be resistant to chemical oxidation". Journal of Biological Chemistry. 260 (11): 6518–21. doi:10.1016/S0021-9258(18)88811-1. PMID 3922976.
27. Yury E. Khudyakov, Howard A. Fields, ed. (25 September 2002). Artificial DNA: Methods and Applications. CRC Press. p. 13. ISBN 9781420040166.